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跨膜蛋白在細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換和信息傳遞中起著關(guān)鍵作用，是細(xì)胞維持正常生命活動(dòng)及對(duì)環(huán)境信號(hào)做出響應(yīng)所必需的。許多跨膜蛋白的生理功能依賴(lài)于與特定配體分子的相互作用。因此，探究跨膜蛋白與配體分子識(shí)別和結(jié)合的機(jī)制一直是生物學(xué)研究的重點(diǎn)課題。從頭設(shè)計(jì)能夠結(jié)合特定配體分子的跨膜蛋白，是蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)領(lǐng)域的重要目標(biāo)之一。實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)不僅在生物傳感、分子檢測(cè)等生物學(xué)工具的研發(fā)領(lǐng)域具有巨大應(yīng)用潛力，還能深化我們對(duì)跨膜蛋白與小分子配體相互作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)，意義重大。
然而，由于膜環(huán)境與膜蛋白本身的復(fù)雜性，膜蛋白在表達(dá)、純化和表征上面臨諸多挑戰(zhàn)，導(dǎo)致其在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（PDB）中的結(jié)構(gòu)數(shù)量相對(duì)較少。人們對(duì)膜蛋白折疊、定位和功能機(jī)制的理解不如水溶蛋白深入，因此跨膜蛋白的從頭設(shè)計(jì)難度更大。由于小分子結(jié)合蛋白的從頭設(shè)計(jì)問(wèn)題尚未完全攻克，再加之跨膜蛋白骨架采樣的局限性以及在疏水性膜環(huán)境中構(gòu)建空腔和極性相互作用等挑戰(zhàn)，使得精確設(shè)計(jì)能夠特異性結(jié)合指定配體的跨膜蛋白成為一項(xiàng)懸而未決的難題。 北京時(shí)間2025年2月20日，西湖大學(xué)未來(lái)產(chǎn)業(yè)研究中心、生命科學(xué)學(xué)院、西湖實(shí)驗(yàn)室盧培龍課題組，在Nature雜志在線(xiàn)發(fā)表題為De novo design of transmembrane fluorescence-activating proteins的論文，首次實(shí)現(xiàn)了跨膜熒光激活蛋白的從頭設(shè)計(jì)，這也是第一個(gè)通過(guò)人工設(shè)計(jì)得到的能夠非共價(jià)結(jié)合特定小分子的跨膜蛋白。 在這項(xiàng)最新研究中，研究團(tuán)隊(duì)使用 Rosetta 軟件進(jìn)行序列設(shè)計(jì)和優(yōu)化，結(jié)合 AlphaFold2 進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和驗(yàn)證。首先設(shè)計(jì)了一個(gè)穩(wěn)定的四螺旋束結(jié)構(gòu)的水溶性熒光激活蛋白（wFAP），該蛋白具有一個(gè)中央口袋，能夠結(jié)合并激活熒光配體（HBC599），其中 wFAP1.1 和 wFAP1.2 變體表現(xiàn)出較高的熒光激活能力和結(jié)合親和力，與 HBC599 的親和力達(dá)到納摩爾級(jí)別，使其熒光亮度激活超過(guò) 1600 倍，結(jié)合態(tài)的亮度和量子產(chǎn)率均優(yōu)于常用的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）。 在 wFAP 的基礎(chǔ)上，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)重新設(shè)計(jì)表面氨基酸殘基，將其轉(zhuǎn)化為跨膜蛋白，同時(shí)盡量減少對(duì)配體結(jié)合口袋結(jié)構(gòu)的擾動(dòng)。使用 ColabDesign 框架進(jìn)行跨膜序列的生成，結(jié)合AlphaFold2 進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和優(yōu)化，從而設(shè)計(jì)出了跨膜熒光激活蛋白（tmFAP）。其中，tmFAP1.2 變體表現(xiàn)出最高的結(jié)合親和力和量子產(chǎn)率。冷凍電鏡結(jié)構(gòu)驗(yàn)證顯示，這些蛋白的結(jié)構(gòu)與設(shè)計(jì)模型高度一致。研究團(tuán)隊(duì)還在活細(xì)菌和真核細(xì)胞中表達(dá)了這些設(shè)計(jì)的 tmFAP 蛋白，結(jié)果顯示，這些蛋白在細(xì)胞中表達(dá)后會(huì)自發(fā)定位到細(xì)胞膜組分中，并能夠特異性激活熒光配體（HBC599）的熒光，且在膜環(huán)境中表現(xiàn)出較高的亮度和量子產(chǎn)率。 該研究采用深度學(xué)習(xí)方法，解決了設(shè)計(jì)跨膜區(qū)時(shí)引起的核心結(jié)構(gòu)及配體結(jié)合口袋結(jié)構(gòu)擾動(dòng)問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了小分子結(jié)合跨膜蛋白的精確設(shè)計(jì)，為跨膜蛋白的從頭設(shè)計(jì)提供了新范式。該方法使小分子結(jié)合跨膜蛋白的設(shè)計(jì)不再依賴(lài)天然蛋白骨架，且可針對(duì)任意小分子進(jìn)行設(shè)計(jì)，為定制化功能的跨膜蛋白從頭設(shè)計(jì)奠定了基礎(chǔ)，如轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白及配體門(mén)控離子通道等。此外，可以沿用設(shè)計(jì) tmFAP 的思路，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)可遺傳編碼的生物探針。在膜蛋白穿膜區(qū)設(shè)計(jì)熒光化學(xué)探針結(jié)合位點(diǎn)，使其響應(yīng)膜兩側(cè)的物理或化學(xué)信號(hào)。這種生物探針不僅具有膜蛋白可控表達(dá)的組織和位置特異性?xún)?yōu)勢(shì)，還兼具化學(xué)探針的高靈敏度和高信噪比特性，在檢測(cè)跨膜電壓和 pH 梯度等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。 在本研究中，使用了Implen Nanophotometer? N60用于跨膜熒光激活蛋白tmFAP的濃度測(cè)量，以通過(guò)公式計(jì)算相對(duì)熒光單位RFU值，獲得tmFAP的熒光表征。Nanophotometer?采用的樣品壓縮法，無(wú)需依賴(lài)于樣品的表面張力，在檢測(cè)過(guò)程中無(wú)需形成樣品液柱，特別適合于測(cè)量膜蛋白的濃度（含去垢劑樣品），廣泛應(yīng)用于（膜）蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究領(lǐng)域，如納米盤(pán)構(gòu)建及冷凍電鏡樣品濃度定量。新的科研成果，總有Implen的身影，Nanophotometer? - 蛋白質(zhì)科學(xué)研究的好伙伴。
