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來源：賽默飛電子商務(wù)平臺
01
目標模板濃度太低
在qPCR 中體現(xiàn)為CT值偏大，復(fù)孔重復(fù)性不佳。
可能的原因1
基因表達豐度低
優(yōu)化建議：選擇高靈敏度、熒光信號強、更寬動態(tài)范圍的qPCR試劑對付低豐度模板；
可能的原因2
模板稀釋過度
優(yōu)化建議：提高模板濃度(濃縮)，減少模板稀釋度（理論上每稀釋10倍，CT 值大 3.3）；
可能的原因3
模板有降解
優(yōu)化建議：重新制備模板，注意選擇好的RNA純化Kit，避免RNA降解，優(yōu)化逆轉(zhuǎn)錄條件。
02
擴增效率異常
擴增效率偏離100%±10% 應(yīng)考慮優(yōu)化。Ct值出現(xiàn)太晚的潛在原因之一是擴增效率低，導(dǎo)致效率低的原因可能有
可能的原因1
反應(yīng)條件未優(yōu)化
優(yōu)化建議：可以在同一實驗中預(yù)設(shè)不同退火溫度，選擇Ct值較小且平臺期熒光強度高的那個溫度；
可能的原因2
存在PCR反應(yīng)抑制劑
優(yōu)化建議：一般反應(yīng)抑制劑多為模板帶入，可考慮重新制備模板或者稀釋模板從而降低抑制劑水平；選擇反應(yīng)性能強健、更耐受抑制劑 的試劑有助于減少此類因素影響；
可能的原因3
模板擴增區(qū)域有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)，高GC含量，影響擴增效率
優(yōu)化建議：同一目標設(shè)計多個擴增區(qū)域/避開二級結(jié)構(gòu)復(fù)雜的區(qū)域；選擇性能強健耐受性高的預(yù)混液，都是可行的解決方法。
03
PCR產(chǎn)物過長影響擴增效率
優(yōu)化建議：
縮短PCR產(chǎn)物長度，控制在100 bp-150 bp之內(nèi)
優(yōu)化建議：
嘗試標準的三步擴增提高擴增效率
優(yōu)化建議：
加長延伸時間使得反應(yīng)完全，以提高擴增產(chǎn)量
04
無Ct值
可能的原因1
循環(huán)數(shù)不夠
優(yōu)化建議：一般反應(yīng)設(shè)置為40個，必要時可增加到45個循環(huán)；
可能的原因2
信號采集設(shè)置不當
優(yōu)化建議：兩步擴增一般將信號采集設(shè)置在退火延伸階段，三步擴增程序應(yīng)當將信號采集設(shè)置在72℃延伸階段。探針法通常在退火結(jié)束時或延伸結(jié)束時采集信號。
01
樣本重復(fù)性差
優(yōu)化建議：
取材部位/處理方式/時間應(yīng)嚴謹?shù)乇Ｕ弦恢?；選擇穩(wěn)定可靠的試劑盒進行樣本制備（如RNA純化盡量選離心柱，帶去除gDNA的）、提取后對RNA的完整度和純度進行檢驗，減少樣本質(zhì)量重復(fù)性差。
02
技術(shù)重復(fù)性差
分為復(fù)孔重復(fù)性差（復(fù)孔之間ΔCt<0.5就算重復(fù)性良好），不同次跑的板間重復(fù)性差。
排查方向有以下——
1
模板濃度低容易出現(xiàn)復(fù)孔重復(fù)性差，若同時Ct值偏大，可嘗試提高模板量。條件允許的話，增加復(fù)孔數(shù)，棄掉偏差大的值也好辦法。
2
加樣誤差是同時影響孔間和板間重復(fù)性的常見原因。良好的操作習(xí)慣有助于提高實驗重復(fù)性，包括：定期校準加樣器能減少不同時期之間的加樣體積偏差；選擇預(yù)混液能減少加樣誤差影響孔間重復(fù)性；低吸附耗材能減少試劑掛壁；穩(wěn)定的操作環(huán)境溫度，反應(yīng)前充分混勻樣品和試劑和離心除氣泡避免影響讀數(shù)，都有助于減少孔間差異和板間差異。注意儀器上不同位置的孔溫度一致性也可能影響孔間一致性。
3
試劑的配液穩(wěn)定性也值得重視。有時候，配置好的反應(yīng)板不一定能馬上上機，等待時長難以確定，導(dǎo)致板間誤差過大——若預(yù)混液能保持足夠長時間的穩(wěn)定性，可確定第一個檢測板的結(jié)果與一個檢測板的結(jié)果相匹配，同時還能提高工作流程的整體便利性。
4
試劑的批間一致性是影響重復(fù)性、實驗前后可比較性的重要因素。定量PCR反應(yīng)體積很小且靈敏度高，不同批次試劑的痕量偏差都可能影響結(jié)果穩(wěn)定。盡量選擇同一批次/批號的試劑，選擇信譽可靠、批間一致性高的產(chǎn)品，有助于提高實驗重復(fù)性和結(jié)果可比較性。
用SYBR Green可以通過測熔解曲線來分析確認反應(yīng)產(chǎn)物特異性，熔解曲線是隨溫度升高DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開程度的曲線：單尖峰提示產(chǎn)物只有一種；多峰則提示有不止一個產(chǎn)物，比如引物二聚體或者非特異擴增。
排查方向有以下——
02
非特異擴增
排查特征：
電泳檢測；雜峰Tm值在80℃之后，目標峰之后的多為非特異擴增；
優(yōu)化建議：
引物設(shè)計特異性不好或者模板質(zhì)量不佳（如含有基因組污染）都可能導(dǎo)致非特異擴增
——建議考慮重新設(shè)計引物或者重新制備模板（記得在RNA純化中用DNase處理降解gDNA）
另外，非特異擴增也可能來自反應(yīng)退火開始前各種非特異延伸，和“實驗室某個角落or空氣中的前任、前前任qPCR” DNA污染！帶有UDG和dUTP配方設(shè)計的預(yù)混液可一步消除掉這類非特異產(chǎn)物；再加上抗體暫時封閉酶活的熱啟動設(shè)計，既能防止退火前的非特異反應(yīng)，又能在退火同時迅速釋放酶活，讓反應(yīng)更快速高效率。
Tips:
1
熔解曲線不理想還可嘗試兩步法，因為二步法擴增特異性高。
2
單峰Tm值在80℃之前考慮沒有模板的可能性
3
單峰不尖要考慮可能有大小接近的非特異擴增
4
Mg2+離子濃度超過3mM以上則易形成引物二聚體，選擇一管全包條件已優(yōu)化的預(yù)混液就不用考慮
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A
兼顧高靈敏度和高特異性：
保障檢測的特異性同時具有更小的Ct 值，低檢出限5拷貝
B
高強度熒光信號：
更大的擴增曲線dRn值，更高的平臺期熒光信號
C
寬動態(tài)范圍：
可在跨6個對數(shù)級動態(tài)范圍內(nèi)進行精準檢測，并確定可靠的線性
D
桌面穩(wěn)定性高：
配置好的qPCR反應(yīng)體系可以在室溫下穩(wěn)定保存72小時
E
批間一致性高：
生產(chǎn)過程遵循ISO 9001質(zhì)量管理體系，保障數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和重復(fù)性
F
抗殘留污染：
采用UDG和dUTP配方，杜絕殘留擴增產(chǎn)物污染造成的假陽性結(jié)果
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