來源：以下文章來源于Cytiva思拓凡 ，作者Li Yafei

2023年2月25日，中華中醫(yī)藥學會發(fā)布了2022年中醫(yī)藥十大學術進展。張伯禮院士指出：2022年度中醫(yī)藥十大學術進展主要呈現(xiàn)的價值，就包括“重視新技術新方法在中醫(yī)藥中的應用”。北京大學醫(yī)學部曾克武教授和屠鵬飛教授與浙江大學、大連醫(yī)科大學、博奧生物研究團隊憑借“新技術助力中藥功效科學內涵闡釋”共同獲選2022年度中醫(yī)藥十大學術進展。

中醫(yī)藥研究者中有廣泛的Biacore用戶基礎，曾克武教授和屠鵬飛教授團隊的這一成果里自然也有Biacore的身影。接下來就讓小編帶您領略Biacore這一現(xiàn)代科技，如何與傳統(tǒng)中醫(yī)藥碰撞并融合，從而闡釋中藥功效科學的內涵。

天然產(chǎn)物中抗腫瘤活性分子

發(fā)現(xiàn)及作用機制揭示1

腫瘤免疫微環(huán)境（Tumor immune microenvironment ，TIME）調控因子IGF2BP1是一種關鍵N6 -甲基腺苷 (m6A) 閱讀蛋白，識別m6A靶點轉錄物，被認為是腫瘤治療的潛在靶點。2022年曾克武教授和屠鵬飛教授團隊發(fā)表的研究成果中，發(fā)現(xiàn)了天然產(chǎn)物葫蘆素B通過結合IGF2BP1發(fā)揮抗腫瘤作用，并且闡釋了作用機制。

以IGF2BP1為出發(fā)點，作者首先發(fā)現(xiàn)，在小鼠H22荷瘤模型中敲低IGF2BP1，可以通過免疫細胞招募和降低TIME中PD-L1的表達來抑制肝細胞癌的進展。使用Biacore 8K，作者驗證了IGF2BP1與甲基化單鏈RNA（ss-m6A）的強親和力，達到了18.3 nM。并且發(fā)現(xiàn)，IGF2BP1與非甲基化RNA（ss-A）的親和力則低了13倍。

確定了治療靶點之后，作者使用Biacore 8K，直接從包含889種化合物的中藥天然產(chǎn)物庫中篩選能抑制IGF2BP1與其m6A靶點的活性分子。通過合成生物素標記的ss-m6A，作者將RNA直接固定在芯片上，將化合物固定濃度（20 μM）與IGF2BP1預孵育，檢測RNA與化合物- IGF2BP1的結合信號，從而直接篩選出具有抑制效果的天然產(chǎn)物（圖1）。

圖1：Biacore 8K抑制劑篩選方法示意圖

通過Biacore 8K的高通量抑制劑篩選實驗，作者得到了抑制劑篩選的排序。從圖2中可以直觀看出，六種具有較強抑制效果的天然產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)，其中抑制效果最強的當屬葫蘆素B（CuB）。在Huh增殖抑制實驗中，葫蘆素B同樣表現(xiàn)出了抑制作用，72h時的IC50達到1.0 uM。

圖2：Biacore 8K抑制劑篩選結果

高通量篩選+精確表征，在藥物研究的各個階段都少不了Biacore。在篩選得到葫蘆素B后，作者當然同樣使用Biacore精確表征了IGF2BP1與葫蘆素B的親和力。結果發(fā)現(xiàn)，二者的親和力達到了1.2 μM，與細胞實驗相互印證（圖3）。

圖3：Biacore精確表征IGF2BP1與CuB的親和力

葫蘆素B又是什么呢？

葫蘆素B是從葫蘆科等植物中分離得到的一類四環(huán)三萜類化合物，具有廣泛的藥理活性。以葫蘆素B為主要成分的葫蘆素制劑在臨床治療濕熱毒盛所致的遷延性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝癌具有確切療效。中藥研究，除了根據(jù)已知靶點從天然產(chǎn)物庫中找活性分子外，另一個角度則是已知活性分子，尋找作用靶點。在通過抑制劑篩選及表征，從靶點IGF2BP1出發(fā)找到活性分子葫蘆素B后，作者使用“鉤釣”的方法，驗證是否能利用葫蘆素B“鉤”出靶點IGF2BP1。

作者首先合成了葫蘆素B分子探針，然后利用pull-down + 質譜的方法從Huh細胞裂解液中成功“鉤”到了靶點IGF2BP1，并且在免疫熒光共定位實驗中證明了細胞中葫蘆素B與IGF2BP1的結合。至此，不論是從靶點出發(fā)找活性分子，還是從活性分子出發(fā)找靶點，雙管齊下，作者明確了葫蘆素B與腫瘤免疫微環(huán)境調控因子IGF2BP1的直接結合。

為了進一步闡釋葫蘆素B的抗腫瘤機制，作者研究了IGF2BP1上葫蘆素B的結合位置及結合方式。將IGF2BP1的結構域逐一刪除后，作者發(fā)現(xiàn)只有缺失了C端KH結構域會使IGF2BP1與葫蘆素B不能結合。通過質譜、pull-down、BLAST、CD等多種方法，作者最終確定，葫蘆素B通過邁克爾加成反應結合在IGF2BP1中KH1?2結構域的Cys253上，并且會引起IGF2BP1的構象變化。

那么葫蘆素B又是如何影響IGF2BP1的功能呢？

IGF2BP1本身會與ss-m6A結合，前面作者使用Biacore做了二者抑制劑的高通量篩選，得到了葫蘆素B。高通量抑制劑篩選能做，單獨的抑制劑表征當然手到擒來。作者設置了Biacore實驗來從生化角度上表征葫蘆素B的抑制效果。從結果可以看出，隨著葫蘆素B的濃度逐漸提高，IGF2BP1與ss-m6A的結合信號越來越低（圖4）。Biacore結果與RNA pull-down實驗一致，明確了葫蘆素B可以抑制二者結合。

圖4：Biacore實驗明確葫蘆素B抑制IGF2BP1與ss m6A的結合

后續(xù)作者還發(fā)現(xiàn)，葫蘆素B可以降低與IGF2BP1所結合的mRNA（包括c-MYC、KRAS 等mRNAs）穩(wěn)定性，在體內通過誘導細胞凋亡，招募免疫細胞到腫瘤微環(huán)境，阻斷PD-L1的表達，最終表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤效果（圖5）。

圖5：文章主要研究路線及作用機制概述

曾克武教授和屠鵬飛教授團隊專注于天然活性分子治療各類型重大疾病的發(fā)現(xiàn)及機制闡釋，開發(fā)了包括分子探針、蛋白芯片2在內的多種靶點“鉤釣”技術，多年以來，許多研究成果中均使用了Biacore作為生物分子相互作用檢測技術。中國科學院院士陳凱先教授指出：年度的學術進展是中醫(yī)藥學術研究的“指南針”和“風向標”。相信此次研究成果的入選，也將為廣大中醫(yī)藥研究者提供更多研究思路，對“積極推進中醫(yī)藥科研和創(chuàng)新，推動傳統(tǒng)中醫(yī)藥和現(xiàn)代科學結合”有重要意義。

Biacore

作為現(xiàn)代化的體外分子互作“金標準”，以其超高的靈敏度，超高的數(shù)據(jù)質量，無分子量檢測下限，適用于各類型的天然產(chǎn)物及生物分子研究，在中醫(yī)藥研究者中有廣泛的用戶基礎。Biacore將持續(xù)與廣大中醫(yī)藥研究者勠力同心，共同推動中醫(yī)藥的現(xiàn)代化研究和應用。

Biacore，for a better life

參考文獻：

[1] Liu Y ,  Guo Q ,  Yang H , et al. Allosteric Regulation of IGF2BP1 as a Novel Strategy for the Activation of Tumor Immune Microenvironment[J].  2022.

[2] Zhang et al. Neuroinflammation inhibition by small-molecule targeting USP7 noncatalytic domain for neurodegenerative disease therapy, Sci. Adv. 8, eabo0789 (2022)