近日
北京市自然科學(xué)基金
資助的重點(diǎn)研究專題項(xiàng)目
“超高分辨冷凍電子顯微鏡
成像方法研究與應(yīng)用”
在該項(xiàng)目支持下，北京大學(xué)毛有東教授團(tuán)隊(duì)于2022年4月27日在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Nature雜志在線發(fā)表了題為“USP14-regulated allostery of the human proteasome by time-resolved cryo-EM”的研究論文，闡明了原子水平人源蛋白酶體動(dòng)力學(xué)調(diào)控和構(gòu)象重編程機(jī)制，并在國(guó)際上展示了人工智能四維重建技術(shù)用于大幅提升時(shí)間分辨冷凍電鏡分析精度。
蛋白酶體功能紊亂與人體多種疾病相關(guān)，如癌癥、神經(jīng)退行性疾病和免疫疾病等。蛋白酶體是美國(guó)FDA批準(zhǔn)的多種治療癌癥的上市小分子藥物的直接靶標(biāo)。
在正常細(xì)胞中，蛋白酶體的功能受到多個(gè)水平的嚴(yán)格調(diào)控。去泛素化酶USP14是主要的蛋白酶體調(diào)控分子，被認(rèn)為是一個(gè)潛力大的治療癌癥和神經(jīng)退行性疾病的重要靶標(biāo)，其小分子抑制劑曾進(jìn)入過美國(guó)一期臨床研究，但圍繞USP14功能機(jī)制的一系列懸而未決的關(guān)鍵問題限制了其靶向藥物分子的開發(fā)和臨床應(yīng)用。USP14通過結(jié)合26S而被激活，然后以毫秒的時(shí)間尺度剪切底物上的泛素鏈。它是如何被蛋白酶體激活并調(diào)控蛋白酶體功能的，一直是研究機(jī)構(gòu)和生物制藥領(lǐng)域期待解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。生命分子機(jī)器通過復(fù)雜的非平衡動(dòng)力學(xué)過程和結(jié)構(gòu)變化來實(shí)現(xiàn)其特殊功能，這一過程進(jìn)而受到各種復(fù)雜分子間相互作用的精準(zhǔn)調(diào)控。如何在原子水平直接觀察天然態(tài)超大分子機(jī)器的功能態(tài)動(dòng)力學(xué)過程，給現(xiàn)有的原子結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)分析技術(shù)提出了挑戰(zhàn)。毛有東教授實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期致力于發(fā)展基于冷凍電鏡的動(dòng)力學(xué)重建方法，圍繞蛋白酶體、炎癥小體等具有重大臨床應(yīng)用前景的靶點(diǎn)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)功能、動(dòng)力學(xué)機(jī)制和靶向調(diào)控分子設(shè)計(jì)深入開展交叉研究。課題組前期的系列工作揭示了蛋白酶體的原子架構(gòu)、組裝原理和降解泛素化底物的動(dòng)力學(xué)基本規(guī)律。
本研究課題進(jìn)行之初，首先要克服的問題就是“時(shí)間分辨”。蛋白酶體降解底物的過程是很快的，時(shí)間尺度在毫秒至秒之間。正常條件下，想要通過冷凍電鏡技術(shù)捕獲此過程的中間態(tài)結(jié)構(gòu)，是非常困難的。所以，課題組首先要讓這個(gè)過程慢下來。通過大量的條件摸索，重建反應(yīng)動(dòng)力學(xué)體系和優(yōu)化反應(yīng)條件，包括優(yōu)化緩沖體系、反應(yīng)溫度等條件，課題組優(yōu)化出較為可行的實(shí)驗(yàn)方案，從而使得時(shí)間分辨冷凍電鏡技術(shù)應(yīng)用成為可能，獲得了含時(shí)的45,193張USP14-26S復(fù)合體降解泛素底物過程中的冷凍電鏡透射圖樣，挑取了3,556,806個(gè)USP14-26S-泛素底物復(fù)合體的顆粒圖像。
接下來面臨的極端挑戰(zhàn)就是“三維分類”，冷凍電鏡捕獲的復(fù)合體圖像需要經(jīng)過一系列的分類，將它們歸為不同的構(gòu)象類別，才能呈現(xiàn)出蛋白反應(yīng)的動(dòng)態(tài)過程。USP14結(jié)合到26S蛋白酶體后，使得降解底物的動(dòng)力學(xué)過程更加復(fù)雜，想要在如此多的異構(gòu)復(fù)合體顆粒圖像中，鑒別出降解過程的各個(gè)時(shí)態(tài)的高分辨率非平衡構(gòu)象，傳統(tǒng)的三維分類方法是無法實(shí)現(xiàn)的。低精度的三維分類將導(dǎo)致低分辯的三維重建，從而無法獲取原子水平的動(dòng)力學(xué)信息，無法對(duì)含時(shí)的數(shù)據(jù)賦予自洽的動(dòng)態(tài)變化的物理意義。課題組結(jié)合經(jīng)過數(shù)年自主開發(fā)的新型深度學(xué)習(xí)高精度三維分類和四維重建方法，捕獲了USP14-26S復(fù)合體降解多泛素化底物過程的13種不同功能中間狀態(tài)的高分辨率（3.0~3.6埃）非平衡構(gòu)象，通過時(shí)間分辨冷凍電鏡分析，重建了受控蛋白酶體的完整動(dòng)力學(xué)工作周期，并結(jié)合分子生物學(xué)功能和基因突變研究，闡明了USP14和26S相互調(diào)控活性的原子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和非平衡動(dòng)力學(xué)機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)USP14的活化同時(shí)依賴于泛素識(shí)別和蛋白酶體RPT1亞基的結(jié)合。出人意料的是，USP14通過別構(gòu)效應(yīng)，誘導(dǎo)蛋白酶體同時(shí)沿著兩條并行狀態(tài)轉(zhuǎn)變路徑發(fā)生構(gòu)象變化；課題組成功捕獲到了底物降解中間狀態(tài)向底物抑制中間狀態(tài)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。在底物降解途徑中，USP14活化變構(gòu)地重編程AAA-ATP酶馬達(dá)的構(gòu)象景觀（Conformational landscape）和統(tǒng)計(jì)分布，并刺激20S底物通道的打開，從而觀察到底物持續(xù)轉(zhuǎn)運(yùn)過程的ATPase六聚馬達(dá)非對(duì)稱ATP水解和近乎完整的全周循環(huán)周期。USP14-ATPase的動(dòng)態(tài)相互作用，使得ATPase馬達(dá)底物識(shí)別與26S自身的去泛素化酶RPN11催化發(fā)生去耦合效應(yīng)，并在26S的泛素識(shí)別、底物的起始易位和泛素鏈回收過程中引入三個(gè)調(diào)控檢查點(diǎn)（動(dòng)力學(xué)分岔點(diǎn)）。這些發(fā)現(xiàn)為USP14調(diào)節(jié)26S的完整功能周期提供了新的高分辨見解，并為USP14靶向藥物治療發(fā)現(xiàn)奠定了極為重要的機(jī)制基礎(chǔ)。
圖2. 通過時(shí)間分辨冷凍電鏡分析獲取的USP14調(diào)控蛋白酶體底物降解的并行路徑模型。（Youdong Mao, CC BY 4.0）
這是將人工智能四維重建技術(shù)用于提升時(shí)間分辨冷凍電鏡分析精度，針對(duì)重大疾病靶蛋白復(fù)合體，實(shí)現(xiàn)原子水平功能動(dòng)力學(xué)觀測(cè)的國(guó)際原創(chuàng)成果，展示了一類新型的蛋白質(zhì)復(fù)合動(dòng)力學(xué)研究范式。Nature同期在線發(fā)表了專欄推介文章，評(píng)價(jià)該成果是一項(xiàng)重大研究，解決了原子水平USP14（泛素特異性肽酶14）活化和其調(diào)控蛋白酶體功能的機(jī)制問題。
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https://doi.org/10.1038/s41586-022-04671-8
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