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外泌體是一類細胞產(chǎn)生的細胞外囊泡 (EVs) ，直徑約40~160 nm，它們攜帶核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和代謝物，是細胞間的通訊介質(zhì)，影響細胞生物學(xué)的各個方面。人體幾乎所有類型的細胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體，外泌體廣泛分布在如血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁等。
由于外泌體等EVs具有高生物利用度、生物穩(wěn)定性、靶向特異性、低毒性和低免疫原性，其在疾病診斷、治療及藥物遞送中潛力。Biacore作為分子互作“金標(biāo)準(zhǔn)”，研究EVs當(dāng)然也離不開ta。
免疫檢查點療法通過調(diào)節(jié)T細胞中的免疫檢查點信號通路來增強抗癌免疫應(yīng)答，取得了重要的臨床進展，然而由于免疫衰竭，超過一半的癌癥患者對這種治療沒有反應(yīng)。北京大學(xué)呂萬良教授團隊針對腫瘤免疫檢查點治療中免疫衰竭與免疫逃逸的問題，重組構(gòu)建了一種基因工程外泌體PD1 - Imi Exo，用于逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫治療中的T細胞衰竭。相關(guān)研究于今年初在線發(fā)表在Bioactive Materials雜志[2]。
圖1：工程化外泌體PD1 - Imi Exo研究路線及作用機制
PD1- Imi Exo通過基因工程設(shè)計PD1，同時包裹一種免疫佐劑Imiquimod，可以首先阻斷CD8+ T細胞與腫瘤細胞的結(jié)合，表現(xiàn)出PD1/PDL1免疫檢查點阻斷作用，并通過釋放Imiquimod促進未成熟樹突狀細胞成熟，激活和恢復(fù)CD8+ T細胞的功能，逆轉(zhuǎn)免疫衰竭（圖1）。 為了驗證PD1 Exo與PDL1的直接結(jié)合，作者使用Biacore分別測定了PDL1與PD1蛋白及與PD1 Exo的結(jié)合（圖2）。作者首先將PDL1蛋白偶聯(lián)在CM5芯片上，PD1蛋白或PD1 Exo作為分析物，測定結(jié)合變化。結(jié)果表明，相較于PD1蛋白，PD1 Exo與PDL1的親和力提高了數(shù)百倍。而除了親和力信息外，Biacore實時檢測的特點可以獲得二者的結(jié)合速率和解離速率信息，相較于PD1蛋白，PD1 Exo與PDL1的解離明顯變慢，說明其與PDL1的結(jié)合更加穩(wěn)定，預(yù)示著其可能具有較長的藥效。
圖2：Biacore檢測PDL1與PD1蛋白 (G) 與PD1 Exo (H) 的結(jié)合
文中實驗還表明，PD1 - Imi Exo呈水泡狀圓形（約139 nm），對腫瘤細胞和樹突狀細胞均有明顯的靶向作用和較強的結(jié)合作用，對黑色素瘤小鼠和乳腺癌小鼠均有顯著的治療效果。本研究也為提高PD1/PDL1的治療效果，通過重建患者的免疫功能來預(yù)防術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，從而鞏固整體預(yù)后提供了一種有希望的新策略。
除了通過基因工程化改造外，胞外對已分離的細胞外囊泡 (EV) 表面進行工程化改造的方法不受細胞活性影響，還可以引入非天然的分子。意大利布雷西亞大學(xué)的研究團隊2023年在Nanoscale Advances發(fā)表的封面文章中，分別利用物理吸附與化學(xué)吸附（利用點擊化學(xué)共價結(jié)合）兩種方法將Cetuximab (CTX) 修飾在Red blood cell EV表面，并使用Biacore檢測兩種方法制備的REV與靶點EGFR結(jié)合的差異[3]。
圖3：抗體EV組裝方法示意圖
作者使用Biacore X100，將EGFR偶聯(lián)在CM5芯片上，分別檢測了EGFR與EGF、CTX、mCTX (modfied CTX) 、天然REVs、四種工程化REVs的親和力。EGF、CTX與EGFR的親和力均與文獻報道相符 (67.3nM、1.8nM) ，而化學(xué)修飾則使CTX的親和力降低，mCTX親和力為3.6nM。在檢測EGFR與外泌體的結(jié)合時，首先天然的REVs未觀察到結(jié)合信號，化學(xué)吸附的REVs-click-mCTX的親和力為0.17nM，高于mCTX十倍，且呈現(xiàn)典型的慢解離過程，物理吸附的外泌體REVs-physi-mCTX親和力與REVs-click-mCTX相當(dāng)。
圖4：Biacore X100檢測EGFR與蛋白或REVs的親和力
此外，作者還發(fā)現(xiàn)，同一張EGFR芯片檢測中，REVs-click-mCTX的飽和結(jié)合信號Rmax比REVs-physi-mCTX高4倍，推測可能時由于物理吸附較弱，當(dāng)mCTX與芯片表面的EGFR結(jié)合更強時，mCTX從REVs上脫落下來，牢牢地結(jié)合在芯片表面地EGFR上，并與REVs-physi-mCTX競爭性結(jié)合EGFR，最終導(dǎo)致芯片表面的最大結(jié)合量Rmax降低。而工程化的REVs-mCTX穩(wěn)定性可能對體外囊泡攝取及其實際治療應(yīng)用具有重要意義，細胞實驗發(fā)現(xiàn)REVs-click-mCTX對靶細胞表現(xiàn)出更好的結(jié)合和攝取能力。
外泌體廣泛分布在血液與體液等液態(tài)標(biāo)本中，通過檢測其內(nèi)容物或表面生物標(biāo)志物等，可以進行精準(zhǔn)的疾病診斷。錫耶納大學(xué)研究團隊發(fā)現(xiàn)黑色素瘤細胞在常氧和缺氧條件下都釋放小細胞外囊泡sEV，但只有缺氧誘導(dǎo)的sEV表達CA-IX mRNA和CA-IX蛋白，據(jù)此開發(fā)一種ELISA檢測方法，相關(guān)成果于2023年發(fā)表在International Journal Of Molecular Sciences[4]。 缺氧處理HEK293pRTS-CA9 cells獲得sEVs后，為了鑒定其表面是否有CA-IX蛋白，作者使用Biacore分別檢測了anti-CA-IX 抗體與CA-IX蛋白及sEVs的結(jié)合，確定了sEVs表面的CA-IX蛋白。
圖5：Biacore檢測anti-CA-IX抗體與CA-IX蛋白及sEVs的結(jié)合
外泌體等細胞外囊泡的功能研究，及其在在治療、診斷領(lǐng)域的開發(fā)愈加火熱，持續(xù)的技術(shù)和實驗進展將會揭示更多其異質(zhì)性和生物學(xué)功能的信息，促進其用于治療和診斷疾病。Biacore作為高靈敏、高精準(zhǔn)的分子互作技術(shù)，可以為各類型分子間的相互作用提供高質(zhì)量的結(jié)合動力學(xué)、親和力、濃度等數(shù)據(jù)，期待與廣大用戶共同發(fā)現(xiàn)更多新療法，新應(yīng)用。
