親和層析主要依靠蛋白質(zhì)與介質(zhì)配體間特異性的可逆結(jié)合作用進(jìn)行分離。配體可直接與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合，也可以與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的標(biāo)簽結(jié)合。親和層析通常是一種最粗放的純化過(guò)程，一般在純化工藝的前期應(yīng)用，可將目標(biāo)物質(zhì)快速的從樣本中捕獲出來(lái)，基于后續(xù)應(yīng)用的要求，可能只需要一步親和層析即可獲得純度合格的蛋白質(zhì)。
蛋白質(zhì)和親和介質(zhì)不結(jié)合標(biāo)簽未翻譯或標(biāo)簽被包裹在結(jié)構(gòu)內(nèi)部
檢查質(zhì)粒序列或?qū)?biāo)簽移到其他位置，標(biāo)簽移到其它位置扔被包裹在結(jié)構(gòu)內(nèi)部時(shí)，就要將標(biāo)簽暴露出來(lái)（如用尿素變性，但尿素變性性只有部分標(biāo)簽蛋白可以和親和填料結(jié)合如His標(biāo)簽蛋白和金屬螯合填料，但GST標(biāo)簽和GST填料就不能在親和結(jié)合）
結(jié)合緩沖液不合適及層析柱沒(méi)平衡好
調(diào)整緩沖液，如金屬螯合介質(zhì)和His標(biāo)簽蛋白結(jié)合時(shí)pH應(yīng)在7.3-8.5之間，在如肝素親和介質(zhì)和DNA聚合酶結(jié)合時(shí)鹽濃度太高影響結(jié)合，應(yīng)控制在50mM以下。層析柱沒(méi)平衡好，柱床體系中的環(huán)境如pH，離子強(qiáng)度也會(huì)影響結(jié)合，層析上樣前要充分的平衡層析柱。
降低上樣流速讓蛋白和介質(zhì)有充分的接觸時(shí)間。
親和介質(zhì)分類，一類是特異性結(jié)合一種蛋白，另一類是特異性結(jié)合一類蛋白。如蛋白a介質(zhì)結(jié)合一種蛋白，而肝素介質(zhì)結(jié)合一類蛋白。所以選擇的時(shí)侯我們一定要了解其原理。
蛋白和介質(zhì)結(jié)合力過(guò)強(qiáng)
增加洗脫強(qiáng)度，比如his蛋白和鎳柱結(jié)合，可以增加取代基咪唑的濃度。
通過(guò)調(diào)整層析過(guò)程的緩沖液增加蛋白的穩(wěn)定性，改善蛋白在層析柱上的狀態(tài)。聚集在層析柱上時(shí)就要對(duì)層析柱進(jìn)行CIP清洗。
調(diào)整層析過(guò)程的流速，流速影響蛋白質(zhì)和介質(zhì)的親和力，層析時(shí)要選擇合適的流速。
上樣后，要對(duì)柱床進(jìn)行充分的淋洗，將未和介質(zhì)結(jié)合的留在介質(zhì)顆粒間隙，孔內(nèi)的蛋白洗出來(lái)，在洗脫。
優(yōu)化體系緩沖液，比如加入10%的甘油等減少蛋白之間的非特異性結(jié)合。
優(yōu)化緩沖液，減少層析過(guò)程的非特異性結(jié)合，如His蛋白用金屬螯合填料純化時(shí)，可以在緩沖液中加入300mM的氯化鈉，減少蛋白和介質(zhì)的非特異性結(jié)合。
如肝素柱子洗脫過(guò)程中拉合適的鹽梯度可以提高特異性，His標(biāo)簽蛋白和金屬螯合介質(zhì)結(jié)合后，洗脫時(shí)拉咪唑梯度可以提高純度。
優(yōu)化緩沖液使其利于蛋白質(zhì)保持穩(wěn)定。蛋白質(zhì)在介質(zhì)上的高密度下容易聚集可以添加一些蛋白的增溶劑等。
純化過(guò)程中保持蛋白的活性的輔助因子被去除
如一些酶類的活性需要金屬離子輔助其活性，在純化過(guò)程中就要添加蛋白的活性輔助因子。
